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基层医院如何制备优质病理切片

       优质的病理切片是做出正确病理诊断的关键,许多所谓的“疑难病理案例”大多数是由于制片质量差所造成的。制作出质量合格的病理切片是医院病理科最基本、也是最重要的工作之一,目前虽已有许多辅助检查手段和工具帮助诊断,如免疫组化和电镜等,但在做这些辅助检查之前,要对该病例有一初步的病理诊断意见,才能考虑用什么手段或工具来进一步证实或否定诊断,而这些只能依靠HE切片,所以高质量的HE切片是完成病理诊断工作的保证,作出正确诊断至关重要。制备一张优质的病理切片并不完全依靠高昂的仪器设备或具备较高资历的技术人员操作来完成,只需技术人员在日常工作中增强责任心、提高质量意识、注重每一个工作环节及细节即可完成。

  1、固定

       良好的固定是制备优质病理切片的第一步,是获得高质量组织切片所必须的。标本固定的好坏直接影响常规制片、免疫组化染色、分子病理检查的质量。首先,标本的固定要符合要求,包括选择优质的固定液、合理掌握固定液使用的温度以及固定液使用的时间等。一般采用10%中性福尔马林溶液,室温固定6~8h是最低要求,24h最理想。固定液量是标本体积的5~10倍,大标本如乳腺、胃大部、肝、脾、肾脏等应按取材规范要求剖开固定过夜。

  2、取材

       病理切片质量的好坏首先取决于取材是否符合操作规范,合理的标本采集是做好病理诊断的第一步,取材部位要合理,所取组织块应具有代表性,尽量显示与病变或肿瘤相关的正常或未累及的组织,切忌人为挤压或冲洗掉部分主观认为是坏死、血块等组织。另外尽量不要触摸腺腔黏膜面,以免造成黏膜脱落。标本取材时,取每一块标本都要考虑到镜下病理诊断的需要,要看到什么结构?为什么要取这里?取材是否充分?是否达到临床分期及预后评估的需要?要想到蜡块包埋时的层次结构是否能切出来?这些对于医师做出正确的病理诊断至关重要。(1)对于质地一致的组织取材厚度要均匀,厚度约3mm为宜,取材过薄,脱水透明过程中会使组织块产生扭曲造成包埋时不平整,在粗修和切片时经常会出现空洞。取材过厚会使组织中心脱水透明浸蜡不好,亦影响切片质量,一般组织块体积不大于2cm×1.5cm×0.3cm。(2)取胆囊、胃壁、宫内膜等带黏膜的脏器时,由于黏膜与黏膜下的组织脱水透明时的“膨胀系数”不一,黏膜面往往会过度收缩,所以取材时如果黏膜下取3mm厚,那么黏膜面就要取3.5mm厚,这样固定透明后的组织会有很平整的“立面”。否则包埋后要修切很深时才能切到黏膜,或造成黏膜面不完整,或切不到黏膜面。(3)取淋巴结或阑尾盲端时,组织表面有浆膜或包膜,取材时要把表面包膜或浆膜去除,否则因“膨胀系数”不一导致脱水透明后切面会皱折、卷曲,切出的组织结构层次就不完整。(4)输卵管妊娠取材时,血块较多,绒毛肉眼不易找见,往往需把所有血块进行取材制片。此时,应注意观察血块,寻找血块含有空隙或密度不一致的地方取血块,这样取到血块中变性绒毛的机率高。或者把组织放入水中,看到疑似漂浮的组织处取材。(5)刮宫等碎组织标本,取材时宜用擦镜纸包裹,后再放入脱水盒内。这样可使碎组织不易从脱水盒漏出污染到其它组织。经脱水透明后碎组织已经“铸造成型”包埋时只需将组织块整块移出,去掉擦镜纸整块放入组织盒内即可,碎组织底部平整易于修整、切片。减少用镊子夹取碎组织所花费的包埋时间,也减少包埋台面被碎组织污染的机会。(6)宫颈等Leep手术标本,取材者必须辨别黏膜面并垂直于每一个片段的长轴做切面取材,组织包埋时“竖立包埋”。(7)活检标本及淋巴结标本往往会大小不一,这时最好把大小较一致的组织或淋巴结放在一个组织盒内,做分开包埋处理,这样能够避免组织因大小混合包埋在一起,不在同一平面,导致切片时有的组织切出来、有的切不出的现象发生。大小不一的组织在包埋时也可进行“分层”包埋,即大的组织紧靠底部并轻压,小的组织位置稍上浮,这样等粗修切片时较大的切到理想切面时,小的组织也被正好切到理想切面。(8)标本取材结束之后脱水处理之前,需将脱水篮置入流水中充分冲洗,然后再进入脱水程序,否则会有较多甲醛色素沉积在组织上。

  3、包埋

       组织的定位或方向是包埋的重要步骤,否则不恰当的组织定位或排列方向会导致切片时毁坏组织。操作时要注意有些组织需“竖立包埋”,如皮肤、囊壁、息肉等,活检组织仔细辨认黏膜面与黏膜下组织(组织颜色较淡),使用放大镜更易识别极向,大部分也可做到“竖立包埋”。这样切片就会显示出清楚的黏膜层、黏膜下层组织层次及浸润深度、息肉蒂部等情况。适宜大小的囊壁样组织,包埋时黏膜面应按同一方向、平行排列包埋,以利于切片及诊断人员对层次的观察。

  4、切片

       (1)切片刀必须保持锋利、无缺口,以保证石蜡切片平整无裂、厚薄均匀。切片中出现不规则、跳片、过厚或过薄等情况需适当调整切片刀的角度;切片中出现波纹、垂直细长的划痕以及切片不成形等需重新更换刀片。(2)冷冻台温度不易过低或组织块在冷冻台上放置时间不易过长,否则会使组织块过度冷冻,切片会出现冻裂,呈“搓衣板”样密集的、平行的、窄细的空白裂隙。特别是淋巴组织过度冷冻,会给病理诊断带来极大的困难,甚至无法诊断。这类组织修整后应适当离开冷冻台一段时间,“回温”后再切片就不会再产生冷冻裂隙。(3)漂片时,首先必须时刻保持清洁、防止切片污染。先将切片光面朝下放入冷水中,再用干净的载玻片将其移入漂片仪的水槽内待充分展平后再迅速裱在载玻片上漂片仪水槽的温度要适宜,一般为45℃左右,过高会使组织特别是碎组织在折叠部分未充分展平的时就很快溶散、碎裂,还会使一些在血管周围的肿瘤组织和远离血管的肿瘤组织分开,结果产生一种以血管为轴心的假乳头结构。过低,仅仅依靠水的表面张力不能把微小折叠部分展平,组织很容易发生折叠现象。(4)注意组织的切片方向,特别是带皮肤的标本。皮肤质韧,不易制片,往往会有折叠或缺损,但只要改变一下切片的方向即刀口先切真皮层面的一侧,后切表皮层面的部分,此问题就会迎刃而解。

  5、染色

       染色步骤如下:(1)脱蜡要彻底,时间要充足,尤其是冬季时。使用的二甲苯、乙醇要适时更换,保证有效浓度,避免因溶解饱和影响脱蜡。(2)从二甲苯缸到无水乙醇缸时,提篮动作要缓慢,要在二甲苯缸上停留一段时间后再放入下一无水乙醇缸,这样可防止带入二甲苯过多,使相邻无水乙醇缸含有高浓度二甲苯后,对切片上的二甲苯溶解去除能力降低,以至于到入苏木精缸前切片上仍含有二甲苯,致水化不全,染色不均,出现切片似污染的“花斑状”现象。(3)各染色缸液体要适时更换,量充足,特别是水洗过程要充分,水洗容器要足够大,一般不要拘于时间,观察每张切片呈均匀、透明时即可进行下一步。(4)染色时,苏木精液体表面一旦出现“金属膜”时就应过滤后再使用,或更换新的苏木精染液,保持清洁,使其着色鲜艳,否则会有苏木精色素沉积在切片上,影响诊断。(5)伊红染色时间过长,或在伊红染色后经乙醇脱水步骤过快,乙醇分化伊红的作用不能产生,会使细胞质过染;但染伊红后脱水时也不要让切片在低浓度乙醇缸内停留时间过长,否则伊红很容易被分化掉,颜色变淡。(6)组织与细胞学染色程序要分开进行,执行两套染色系统,否则细胞学上脱落的细胞往往会污染到组织切片上,影响诊断。

  6、封固

       封固时,中性树胶浓度和量应适当,否则易产生外溢或空泡等。


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